色譜法是一種分離分析方法。它利用樣品中各組分與流動相和固定相的作用力不同(吸附、分配、交換等性能上的差異)，先將它們分離，后按一定順序檢測各組分及其含量的方法。

? 色譜法的分離原理

當混合物隨流動相流經色譜柱時，就會與柱中固定相發生作用(溶解、吸附等)，由于混合物中各組分物理化學性質和結構上的差異，與固定相發生作用的大小、強弱不同，在同一推動力作用下，各組分在固定相中的滯留時間不同，從而使混合物中各組分按一定順序從柱中流出。這種利用各組分在兩相中性能上的差異，使混合物中各組分分離的技術，稱為色譜法。

? 流動相

色譜分離過程中攜帶組分向前移動的物質。

? 固定相

色譜分離過程中不移動的具有吸附活性的固體或是涂漬在載體表面的液體。

? 色譜法的特點

(1)分離效率高，復雜混合物，有機同系物、異構體；

(2)靈敏度高，可以檢測出μg.g-1(10-6)級甚至ng.g-1(10-9)級的物質量；

(3)分析速度快，一般在幾分鐘或幾十分鐘內可以完成一個試樣的分析；

(4)應用范圍廣，氣相色譜：沸點低于400℃的各種有機或無機試樣的分析。液相色譜：高沸點、熱不穩定、生物試樣的分離分析；

(5)高選擇性，對性質極為相似的組分有很強的分離能力。不足之處是被分離組分的定性較為困難。

? 色譜分析法的分類

(1)按兩相狀態分類

a.氣相色譜(Gas Chromatography, GC)

流動相為氣體(稱為載氣)。常用的氣相色譜流動相有N2、H2、He等氣體，按分離柱不同可分為填充柱色譜和毛細管柱色譜；按固定相的不同又分為氣固色譜和氣液色譜。

b.液相色譜(Liquid Chromatography, LC)

流動相為液體(也稱為淋洗液)。按固定相的不同分為液固色譜和液液色譜。

c.超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

流動相為超臨界流體。一種介于氣體和液體之間的狀態。超臨界流體色譜法是集氣相色譜法和液相色譜法的優勢而發展起來的一種新型的色譜分離分析技術，不僅能夠分析氣相色譜不宜分析的高沸點、低揮發性的試樣組分，而且具有比高效液相色譜更快的分析速率和更高的柱效率。

(2)按操作形式分類

a.柱色譜(Column Chromatography, CC)

固定相裝在柱管內，包括填充柱色譜和毛細管柱色譜。

b.紙色譜(Paper Chromatography, PC)

固定相為濾紙；采用適當溶劑使樣品在濾紙上展開而進行分離。

c.薄層色譜(Thin Layer Chromatography, TLC)

固定相壓成或涂成薄層，操作方法同紙色譜。

(3)按分離原理分類

a.吸附色譜(Absorption chromatography)

b.分配色譜(Partition Chromatography)

c.離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)

d.凝膠色譜(Gel Chromatography)

? 色譜圖

組分在檢測器上產生的信號強度對時間(t)所作的圖，由于它記錄了各組分流出色譜柱的情況，所以又叫色譜流出曲線。流出曲線的突起部分稱為色譜峰。

? 色譜保留值

色譜定性分析的依據，它體現了各待測組分在色譜柱上的滯留情況。在固定相中溶解性能越好，或與固定相的吸附性能越強的組分，在柱中的滯留時間越長，或者說將組分帶出色譜柱所需的流動相體積越大。所以保留值可以用保留時間和保留體積兩套參數來描述。

? 色譜圖上的色譜流出曲線

根據色譜峰的數目，可判斷樣品中所含組分的最少個數。根據色譜峰的保留值進行定性分析；根據色譜峰的面積或峰高進行定量分析；根據色譜峰的保留值和區域寬度評價色譜柱的分離效能；根據兩峰間的距離，可評價固定相及流動相選擇是否合適。

? 分配比

在一定溫度下，組分在兩相間分配達到平衡時的質量比。

? 在色譜流出曲線上，兩峰之間的距離主要由兩組分在兩相間的分配系數還是擴散速度決定？為什么這樣說？

是因為分配系數。兩峰間的距離由熱力學因素決定，兩組分在兩相中分配系數差異越大，兩峰間的距離則相差越大，越容易被分離。而擴散速度是動力學因素，反映在色譜流出曲線上即為色譜峰的區域寬度(形狀)。

? 色譜理論需要解決的問題

色譜分離過程的熱力學和動力學問題。影響分離及柱效的因素與提高柱效的途徑，柱效與分離度的評價指標及其關系。

? 組分保留時間為何不同？

色譜過程的熱力學因素控制(組分和固定液的結構和性質)。

? 色譜峰為何變寬？

色譜過程的動力學因素控制(兩相中的運動阻力，擴散作用)。塔板理論和速率理論分別從熱力學和動力學的角度闡述了色譜分離效能及其影響因素。

(1)塔板理論

引入了塔板數和塔板高度作為柱效的衡量指標。不同物質在同一色譜柱上的分配系數不同，用有效塔板數和有效塔板高度作為衡量柱效能的指標時，應指明測定物質。柱效不能表示被分離組分的實際分離效果，當兩組分的分配系數K相同時，無論該色譜柱的塔板數多大，都無法分離。不足之處在于其基本假設不符合色譜柱的實際分離過程。塔板理論無法解釋同一色譜柱在不同的流動相流速下柱效不同的實驗結果，不能說明色譜峰為什么會變寬，同時未能指出影響柱效的因素及提高柱效的途徑和方法。

(2) 速率理論

組分分子在柱內運行的多路徑與渦流擴散、濃度梯度所造成的分子擴散及傳質阻力使兩相間的分配平衡不能瞬間達到等因素，是造成色譜峰擴展、柱效下降的主要原因。通過選擇適當的固定相粒度、載氣種類、液膜厚度及載氣流速可提高柱效。速率理論為色譜分離和操作條件選擇提供了理論指導。闡明了流速和柱溫對柱效及分離的影響。各種因素相互制約，如載氣流速增大，分子擴散項的影響減小，使柱效提高，但同時傳質阻力項的影響增大，又使柱效下降；柱溫升高，有利于傳質，但又加劇了分子擴散的影響。選擇最合適的條件才能使柱效達到最高。

? 色譜定性方法

(1)定量校正因子

試樣中各組分質量與其色譜峰面積成正比，即：mi = fi’?Ai。

(2)絕對校正因子

比例系數f i，單位面積對應的物質量：f i’=m i / Ai 。

(3)相對校正因子fi

即組分的絕對校正因子與標準物質的絕對校正因子之比。

(4)常用的幾種定量方法

a.歸一化法

歸一化法簡便、準確。進樣量的準確性和操作條件的變動對測定結果影響不大，僅適用于試樣中所有組分全出峰的情況。

b.外標法-標準曲線法

外標法不使用校正因子，準確性較高，操作條件變化對結果準確性影響較大。對進樣量的準確性控制要求較高，適用于大批量試樣的快速分析。

c.內標法

內標法的準確性較高，操作條件和進樣量的稍許變動對定量結果的影響不大。每個試樣的分析，都要進行兩次稱量，不適合大批量試樣的快速分析。若將內標法中的試樣取樣量和內標物加入量固定，則：wi=Ai/As*常數。其內標物要滿足以下要求：

(a)試樣中不含有該物質；

(b)與被測組分性質比較接近；

(c)不與試樣發生化學反應；

(d)出峰位置應位于被測組分附近，且能分離開；

(e)加入量適中并與待測組分接近。